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高效液相色譜法

信息來源：中國藥典2000年版二部附錄更新時間：2006-12-100:34:04
生物谷網站ahref="www.bioon"target="_blank"www.bioon/a標題高效液相色譜法
附錄序號附錄ⅵ
內容全文 d.高效液相色譜法
高效液相色譜法是用高壓輸液泵將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，經進樣閥注入供試品，由流動相帶入柱內，在柱內各成分被分離後，依次進入檢測器，色譜信號由記錄儀或積分儀記錄。
1.對儀器的一般要求
所用的儀器為高效液相色譜儀。色譜柱的填料和流動相的組分應按各品種項下的規定.常用的色譜柱填料有硅膠和化學鍵合硅膠。後者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用,辛基鍵合硅膠次之,氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料,用於離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用於分子排阻色譜等。注樣量一般為數微升，除另有規定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。
在用紫外吸收檢測器時,所用流動相應符合紫外分光光度法（附錄ⅳa）項下的對溶劑的要求。
正文中各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變,以適應具體品種並達到系統適用性試驗的要求。一般色譜圖約於20分鐘內記錄完畢。
2.色譜條件與系統適用性試驗
按各品種項下的要求對儀器進行適用性試驗，即用規定的對照品對儀器進行試驗和調整，應達到規定的要求；或規定分析狀態下色譜柱的最小理論板數、分離度和拖尾因子。
(1)色譜柱的理論板數(n)在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內標物質峰的保留時間tr（以分鐘或長度計，下同,但應取相同單位）和半高峰寬(wh/2)，按n=5.54(tr／wh/2)<2>計算色譜柱的理論板數，如果測得理論板數低於各品種項下規定的最小理論板數，應改變色譜柱的某些條件（如柱長，載體性能，色譜柱充填的優劣等），使理論板數達到要求。
(2)分離度
定量分析時，為便於准確測量，要求定量峰與其他峰或內標峰之間有較好的分離度。分離度（r）的計算公式為：
  2(tr<[2]>-tr<[1]>)
r＝——————————
  w<[1]>＋w<[2]>
式中
tr<[2]>為相鄰兩峰中後一峰的保留時間；
tr<[1]>為相鄰兩峰中前一峰的保留時間；
w<[1]>及w<[2]>為此相鄰兩峰的峰寬。
除另外有規定外，分離度應大於1.5。
(3)拖尾因子
為保證測量精度，特別當采用峰高法測量時，應檢查待測峰的拖尾因子(t)是否符合各品種項下的規定,或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為：
  w<[0.05h]>
t＝——————
  2d<[1]>
式中
w<[0.05h]>為0.05峰高處的峰寬；
d<[1]>為峰極大至峰前沿之間的距離。
除另有規定外，t應在0.95～1.05間。
也可按各品種校正因子測定項下，配制相當於80％、100％和120％的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別注樣3次,計算平均校正因子，其相對標准偏差應不大於2.0％。
3.測定法
定量測定時，可根據樣品的具體情況采用峰面積法或峰高法。但用歸一法或內標法測定雜質總量時，須采用峰面積法。
(1)面積歸一化法
測定供試品（或經衍生化處理的供試品）中各雜質及雜質的總量限度采用不加校正因子的峰面積歸一法。計算各雜質峰面積及其總和，並求出占總峰面積的百分率。但溶劑峰不計算在內。色譜圖的記錄時間應根據各品種所含雜質的保留時間決定，除另有規定外,可為該品種項下主成分保留時間的倍數。
(2)主成份自身對照法
當雜質峰面積與成分峰面積相差懸殊時，采用主成分自身對照法。在測定前，先按各品種項下規定的雜質限度，將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對照溶液，進樣，調節檢測器的靈敏度或進樣量，使對照溶液中的主成分色譜峰面積滿足准確測量要求。然後取供試品溶液，進樣，記錄時間，除另有規定外，應為主成分保留時間的倍數。根據測得的供試品溶液的各雜質峰面積及其總和並和對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質限度。
(3)內標法測定供試品中雜質的總量限度
采用不加校正因子的峰面積法。取供試品，按各品種項下規定的方法配制不含內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖i；再配制含有內標物質的供試品溶液，在同樣的條件下注樣，記錄色譜圖ⅱ。記錄的時間除另有規定外，應為該品種項下規定的內標峰保留時間的倍數，色譜圖上內標峰高應為記錄儀滿標度的30％以上，否則應調整注樣量或檢測器靈敏度。
如果色譜圖ⅰ中沒有與色譜圖ⅱ上內標峰保留時間相同的雜質峰，則色譜圖ⅱ中各雜質峰面積之和應小於內標物質峰面積（溶劑峰不計在內）。如果色譜圖ⅰ中有與色譜圖ⅱ上內標物質峰保留時間相同的雜質峰，應將色譜圖ⅱ上的內標物質峰面積減去色譜圖ⅰ中此雜質峰面積，即為內標物質峰的校正面積；色譜圖ⅱ中各雜質峰總面積加色譜圖ⅰ中此雜峰面積，即為各雜質峰的校正總面積，各雜質峰的校正總面積應小於內標物質峰的校正面積。
(4)內標法加校正因子測定供試品中某個雜質或主成分含量
按各品種項下的規定,精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：
     a<[s]>／m<[s]>
校正因子（f）＝———————
     a<[r]>／m<[r]>
式中
a<[s]>為內標物質的峰面積或峰高；
a<[r]>為對照品的峰面積或峰高；
m<[s]>為加入內標物質的量；
m<[r]>為加入對照品的量。
再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品（或其雜質）峰和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量：
      a<[x]>
含量(m<[x]>)＝f×———————
      a<[s]>／m<[s]>
式中
a<[x]>為供試品（或其雜質）峰面積或峰高；
m<[x]>為供試品（或其雜質）的量；
f、a<[s]>和m<[s]>的意義同上。
當配制校正因子測定用的對照溶液和含有內標物質的供試品溶液使用同一份內標物質溶液時，則配制內標物質溶液不必精密稱（量）取。
(5)外標法測定供試品中某個雜質或主成分含量
按各品種項下的規定,精密稱(量)取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和供試品待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量：
      a<[x]>
含量(m<[x]>)＝m<[r]>×————
      a<[r]>
式中各符號意義同上
由於微量注射器不易精確控制進樣量，當采用外標法測定供試品中某雜質或主成分含量時，以定量環進樣為好。

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