hoechst 33342 染色的原理？

hoechst33342染色的原理？和pi染色有什麼區別

??hoechst33342，也稱bisbenzimideh33342或hoe33342。分子式為c27h28n6o??3hcl??3h2o，分子量為615.99，casnumber23491-52-3。
??hoechst33342是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，對細胞的毒性較低。
??hoechst33342染色常用於細胞凋亡檢測，染色後用熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測。hoechst33342也常用於普通的細胞核染色，或常規的dna染色。
??hoechst33342的最大激發波長為346nm，最大發射波長為460nm；hoechst33342和雙鏈dna結合後，最大激發波長為350nm，最大發射波長為461nm。
??hoechst33342溶於水，溶解度可達20mg/ml。
??用於細胞核染色時，推薦的hoechst33342工作濃度為0.5-10微克/毫升。

熒光染料hoechst33342能少許進入正常細胞膜，使其染上低藍色，而凋亡細胞的膜通透性增強，因此進入凋亡細胞中的hoechst33342比正常細胞的多，熒光強度要比正常細胞中要高，此外，凋亡細胞的染色體dna的結構發生了改變從而使該染料能更有效地與dna結合，並且凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將hoechst33342排出到細胞外使之在細胞內積累增加等都使凋亡細胞的藍色熒光增強。而pi染料是不能進入細胞膜完整的正常細胞和凋亡細胞中，即活細胞對pi染料拒染，而壞死細胞由於膜完整性在早期即已破損，可被pi染料染色。根據這些特性，用hoechst33342結合pi染料對凋亡細胞進行雙染色，就可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區別開來。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，這三群細胞表現分別為：正常細胞為低藍色/低紅色（hoechst33342+/pi+），凋亡細胞為高藍色/低紅色（hoechst33342++/pi+），壞死細胞為低藍色/高紅色（hoechst33342+/pi++）。

使用說明：

1.對於固定的細胞或組織：
a.對於細胞或組織樣品，固定後，適當洗滌去除固定劑。隨後如果需要進行免疫熒光染色，則先進行免疫熒光染色，染色完畢後再按後續步驟進行hoechst33342染色。如果不需要進行其它染色，則直接進行後續的hoechst33342染色。
b.對於貼壁細胞或組織切片，加入少量hoechst33342染色液，覆蓋住樣品即可。對於懸浮細胞，至少加入待染色樣品體積3倍的染色液，混勻。室溫放置3-5分鐘。
c.吸除hoechst33342染色液，用tbst、pbs或生理鹽水洗滌2-3次，每次3-5分鐘。
d.直接在熒光顯微鏡下觀察或封片後熒光顯微鏡下觀察。細胞發生凋亡時，會看到凋亡細胞的細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。
2.對於活細胞或組織：
a.加入適當量hoechst33342染色液，必須充分覆蓋住待染色的樣品，通常對於六孔板一個孔需加入1ml染色液，對於96孔板一個孔需加入100微升染色液。
b.在適宜於細胞培養的溫度培養20-30分鐘。棄染色液，用pbs或培養液洗滌2-3次即可進行熒光檢測。